Kloning Gen

Sejak ditemukannya enzim restriksi (enzim yang dapat memotong DNA pada urutan yang spesifik) dan ditemukannya enzim ligase (enzim yang dapat menyambungkan potongan DNA), maka DNA dari organisme apa saja dapat diisolasi, dipotong-potong, disambungkan kembali dan dipindahkan ke organisme lain. Proses mengkombinasikan beberapa DNA dan memperbanyak DNA rekombinan tersebut di dalam sel disebut kloning. Proses memasukkan DNA ke dalam sel disebut transformasi dan sel yang dihasilkan disebut transforman. Agar suatu DNA dapat diperbanyak di dalam sel, maka DNA tersebut harus disisipkan ke dalam suatu plasmid (berfungsi sebagai vektor/pembawa) yang dapat bereplikasi di dalam sel. Kumpulan sel-sel yang mengandung plasmid rekombinan yang sama disebut sebagai suatu klon.

Pada kloning gen: suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan di klon disisipkan pada molekul DNA vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan ini digunakan untuk mentransformasi sel inang (biasanya bakteri). Di dalam sel, vektor mengadakan replikasi, menghasilkan banyak copy atau turunan yang identik, baik vektornya maupun gen yang dibawanya. Ketika sel inang membelah, copy molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeni. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klon sel inang yang identik. Tiap-tiap klon mengandung satu copy atau lebih molekul DNA rekombinan.

Kloning melibatkan lima komponen utama, yaitu : fragmen DNA (gen) yang akan di kloning (disebut juga DNA sisipan), DNA vektor (bisa plasmid, bakteriofaga atau cosmid), enzim restriksi, enzim ligase dan sel inang (bakteri atau ragi).

DNA sisipan.

Tujuan kloning adalah memperbanyak suatu fragmen DNA dari suatu organisme dalam suatu sel inang. Namun tujuan akhirnya bisa bermacam-macam, diantaranya: produksi protein penting dengan skala besar, untuk deteksi patogen atau sel abnormal. DNA sisipan bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu :

1. Produk PCR.

2. Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi

DNA vektor

Vektor merupakan suatu mulekul DNA sirkular yang bertindak sebagai wadah untuk membawa DNA sisipan masuk ke dalam sel inang dan bertanggung jawab atas replikasinya. Berdasarkan fungsinya vektor dapat dibagi dua, yaitu : vektor kloning dan vektor ekspresi. Vektor kloning hanya berfungsi untuk memperbanyak fragmen DNA yang disisipkan, sehingga fragmen DNA tersebut hanya direplikasi, tidak di transkripsi. Biasanya vektor ini digunakan untuk tujuan sekuensing atau untuk perbanyakan DNA yang nantinya akan di sisipkan ke vektor ekspresi. Sementara vektor ekspresi digunakan untuk memproduksi protein dari gen yang diklon.

Syarat suatu vektor adalah : (1) mampu memasuki sel inang, (2) bereplikasi sendiri (memiliki ori), (3) menghasilkan jumlah copy yang banyak dan (4) mempunyai ukuran yang relatif kecil (< 10 kb). Molekul DNA yang memenuhi persyaratan tersebut adalah : plasmid dan kromosom virus terutama bakteriofaga.

Plasmid

Plasmid merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkular dan terdapat bebas di dalam sel. Plasmid dapat bereplikasi sendiri di dalam sel inang karena mempunyai suatu urutan DNA spesifik yang disebut ori (origin of replication/titik awal replikasi). Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih yang menyebabkan ciri-ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri inang, misalnya plasmid yangmembawa gen resistan antibiotik

Banyak spesies bakteri mempunyai plasmid, tetapi plasmid yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan bukan plasmid dalam bentuk alami, melainkan yang sudah direkayasa. Plasmid tersebut telah diberi sisi pengenalan beberapa enzim restriksi agar dapat disisipi dengan DNA asing. Plasmid juga telah diberi dua gen marker, satu gen diperlukan untuk mendeteksi dengan mudah adanya plasmid di dalam sel, dan gen yang kedua diperlukan untuk mendeteksi adanya DNA asing.

Bakteriofaga

Bakteriofaga merupakan virus yang menginfeksi bakteri. Bakteriofaga mempunyai struktur yang sangat sederhana, hanya terdiri dari satu molekul DNA atau RNA yang membawa sejumlah gen, dan dikelilingi oleh selubung atau kapsid yang disusun oleh molekul protein. Pada proses infeksi bakteri oleh faga, partikel faga melekat pada bagian luar bakteri dan memasukkan DNA kromosomnya ke dalam sel. Molekul DNA faga kemudian mengadakan replikasi, gen-gen faga mengatur sintesis protein komponen kapsid. Partikel-partikel faga yang baru kemudian dirakit dan dilepaskan dari bakteri. Sel bakteri mengalami lisis. Sama seperti plasmid, DNA faga yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan umumnya sudah dimodifikasi dengan penambahan sisi restriksi. Perbedaanya dengan plasmid, bakteriofaga dapat menampung fragmen DNA dengan ukuran yang lebih besar.

Leave a Comment